Kapillarzonen-Elektrophorese (CE)

Um dem Problem der Wärmeproduktion (Joule’sche Wärme) bei Anlegen einer Spannung zur Trennung von Komponenten A_i einer Mischung S A_i entgegenzuwirken, werden anstelle kompakter Gele (PAGE) Kapillaren mit Durchmessern von einigen 10 m m zum Einsatz gebracht. Die zum Einsatz gebrachten Kapillaren

• amorpher Quarz (fused silica)
• beschichteter amorpher Quarz

weisen, im Vergleich mit kompakten Gelen

• ein wesentlich günstigers Oberflächen/Volumen-Verhältnis auf
• ermöglichen raschen Wärmetransport aus dem Probenvolumen
• erlauben aufgrund des raschen Wärmeexportes sehr hohe Feldstärken
• und weisen hohe Trennkapazität (mehrere 10⁵ theoretische Böden) auf.

Im Vergleich zu üblicher Gel-Elektrophorese

• entfällt die Notwendigkeit des Anfärbens zu Identifikation
• sind rasche Trennungen erzielbar (wenige Minuten)
• sind nur nL Probenmengen erforderlich
• kann die Experimentalanordnung gut automatisiert werden.

Die Trennung der Komponenten A_i erfolgt, wie bei der Gelelektrophorese, aufgrund unterschiedlicher, effektiver Beweglichkeiten der einzelnen Komponeten.

Die Effektivität der Beweglichkeit wird dabei vor allem durch den Dissoziationsgrad der komponenten bestimmt und hängt daher in hohem Masse vom pH der Elektrolytlösung ab. Wanderungsgeschwindigkeiten liegen typischerweise zwischen 6-10 cm/min.

Im Gegensatz zu ersten Erwartungen, dass mit solchen Systemen nur Kationen aufgetrennt werden können, beobachtet man aber, dass sehr wohl auch unterschiedliche Wanderugszeiten für Neutralsubstanzen und Anionen bei Durchtritt durch die Kapillare auftreten. Die Elutionsreihenfolge ist:

• Kationen
• Neutralsubstanzen
• Anionen

Der Grund für die Auftrennung von Neutralsubstanzen und Anionen liegt in der Ausbildung einer dem ursprünglich angelegten Feld entgegengerichteten elektrischen Doppelschicht zwischen der negativ geladenen Silikatoberfläche und der Elektrolytlösung (Zeta-Potential). Diese sorgt dafür,

• dass die Anionen von den Neutralsubstanzen getrennt werden
• und verschiedene Anionen, abhängig von ihrer effektiven Beweglichkeit aufgespalten werden.

Wenn dem angelegten Feld in einer beschichteten Kapillare noch zusätzlich ein pH-Gradient überlagert wird, spricht man von isoelektrischer Fokusierung (IEF). Dazu ist ein Mehr-Stufen-Prozess erforderlich:

• Vorbereitung unterschiedlicher Elektrolytlösungen (Puffer) an der Anode (Na OH) und der Kathode (H₃PO₄);
• Befüllen der Kapillare mit Elektrolytlösung, Ampholyt und Probenteilchen;
• Einschalten des Feldes, sodass der Ampholyt (typischer pH Bereich 3-10) sich mit seinen Ladungen ausrichtet und zwischen den Elektroden zum elektrischen Feld ein pH-Gradient aufgebaut wird: Fokusierung der unterschiedlichen Teilchen an der Position ihres iso-elektrischen Punktes;
• Mobilisierung, üblicherweise des kompletten Säuleninhaltes mittels Druck oder Unterdruck (Vakuum), oder durch pH-induzierten Ladungswechsel (NaCl zum Kathodenpuffer ® Austausch der OH^- gegen Cl^- bewirkt einen pH-Sprung und alle nun durch Protonierung positiv geladenen Banden wandern zur Kathode, vor deren Erreichen der Detektor installiert ist;)

Bei der Isotachophorese (ITP) werden die Bestandteile einer Probe zwischen

• einem führenden Elektrolyten
• und einem terminierenden Elektrolyten

nach ihrer individuellen Leitfähigkeit, nach abnehmender Mobilität sortiert.

Nach ihrer Positionierung im Feld wandern alle Komponenten mit gleicher Geschwindigkeit.

• In Banden mit niederiger Mobilität herrscht ein starkes elektrisches Feld,
• in Banden hoher Mobilität liegt ein vergleichsweise niedriges Feld vor.

Bei der Bestimmung von Kationen ist der führende Elektrolyt ein Kation mit hoher Mobilität (beispielsweise Protonen) - als Terminator muss ein Elektrolyt mit einer Mobilität gewählt werden, die kleiner ist, als jene der geringsten Komponenten-Mobilität.

Da die Konzentration von Anionen im gesamten System konstant ist, muss gleiches auch für die Kationen gelten. Die Länge einer Bande ist daher ein quantitatives Mass für die Absolutmenge eines bestimmten Kations.

Detektion aufgetrennter Komponenten erfolgt üblicherweise mit

• UV (direkt: Chromophor in den Komponenten A_i)

• UV (indireket: Chromophor im Eluenten)

• Fluoreszenz (direkt anregbare A_i, derivatisierte A_i)

• Leitfähigkeit